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分子生物學(xué)實驗基礎(chǔ)知識
更新時間:2017-05-24 點擊次數(shù):2788

分子生物學(xué)是在生物化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,以研究核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等生命本質(zhì)的學(xué)科,在核酸、蛋白質(zhì)分子水平研究發(fā)病、診斷、治療和預(yù)后的機制。其中基因工程(基因技術(shù),基因重組)是目前分子生物學(xué)研究熱點,這些技術(shù)可以改造或擴增基因和基因產(chǎn)物,使微量的研究對象達到分析水平,是研究基因調(diào)控和表達的方法,也是分子水平研究疾病發(fā)生機制、基因診斷和基因治療的方法。轉(zhuǎn)化(transformation)、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)位等是自然界基因重組存在的方式,也是人工基因重組常采用的手段?;蛑亟M的目的之一是基因克(gene clone),基因克隆可理解為以一分子基因為模板擴增得到的與模板分子結(jié)構(gòu)*相同的基因。使需要分析研究的微量、混雜的目的基因易于純化,得以增量,便于分析?! ?/span>

     外來基因引起細胞生物性狀改變的過程叫轉(zhuǎn)化(transformation),以噬菌體把外源基因?qū)爰毦倪^程叫轉(zhuǎn)染(transfection)。利用載體(噬菌體或病毒)把遺傳物質(zhì)從一種宿主傳給另一種宿主的過程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。一個或一組基因從一處轉(zhuǎn)移到基因組另一處的過程叫轉(zhuǎn)位(transposition),這些游動的基因叫轉(zhuǎn)位子。 

    一、基因工程的常用工具  

(一)載體  

 載體(Vector)是把外源DNA(目的基因)導(dǎo)入宿主細胞,使之傳代、擴增、表達的工具。載體有質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質(zhì)粒(粘粒)、病毒等。載體具有能自我復(fù)制;有可選擇的,便于篩選、鑒定的遺傳標記;有供外源DNA插入的位點;本身體積小等特征。  

質(zhì)粒存在于多種細菌,是染色體(核)以外的獨立遺傳因子,由雙鏈環(huán)狀DNA組成,幾乎*裸露,很少有蛋白質(zhì)結(jié)合。質(zhì)粒有嚴緊型和松弛型之分。嚴緊型由DNA多聚酶Ⅲ復(fù)制,一個細胞可復(fù)制1-5個質(zhì)粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復(fù)制,一個細胞可復(fù)制30-50個質(zhì)粒,如果用氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成,使質(zhì)粒有效利用原料,復(fù)制更多的質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)過改造品種繁多,常用的有pBR322、pUC系列等。這些質(zhì)粒都含有多個基本基因,如復(fù)制起動區(qū)(復(fù)制原點Ori),便于復(fù)制擴增;抗抗生素標記(抗氨芐青霉素Apr、抗四環(huán)素Tcr等)或大腸埃希菌部分乳糖操縱子(E.coli LacZ)等,便于基因重組體的篩選;基因發(fā)動子(乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等)和轉(zhuǎn)錄終止序列,便于插入的外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達。質(zhì)粒上還有許多限制性內(nèi)切酶的切點,即基因插入位點,又叫基因重組位點,基因克隆位點?! ?/span>

常用噬菌體載體有單鏈噬菌體M13系統(tǒng);雙鏈噬菌體系統(tǒng)。噬菌體應(yīng)和相應(yīng)的宿主細胞配合使用。以上載體各有特點,便于選擇,靈活應(yīng)用?! ?/span>

(二)工具酶  

     工具酶是基因重組技術(shù)*的工具。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶等。  限制性內(nèi)切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶之分,Ⅱ型能嚴格識別核酸序列,并在識別區(qū)內(nèi)特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶。識別分四核苷酸和六核苷酸,其序列旋轉(zhuǎn)對稱。切口分開端和粘端,產(chǎn)生3′-OH和5′-P末端。內(nèi)切酶品種多,使用時應(yīng)注意溫度、緩沖液用量(一般1μg DNA/2-5單位酶)等反應(yīng)條件。
酶識別序列切口

 Alu Ⅰ…AGCT……AG CT…四核苷酸 

  …TCGA……TC GA…平端切口Eco 

  R1…GAATTC……G AATTC…六核苷酸 

  …CTTAAG……CTTAA G…粘端切口
  連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端,也連接粘端。反應(yīng)需有Mg2+和ATP存在,pH7.5-7.6。zui適溫度37℃,30℃以下活性明顯下降,但考慮到被連接DNa 的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度,一般平端連接用20-25℃,粘端連接用12℃左右?! ?/span>    

聚合酶有DNA聚合酶(以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ,大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow大片段),T4或T7噬菌體DNA聚合酶等);RNA聚合酶(以DNA為模板合成RNA,T7或T3噬菌體RNA聚合酶);逆轉(zhuǎn)錄酶(以RNA為模板合成DNA,除RNA病毒中發(fā)現(xiàn)外,發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉(zhuǎn)錄活性)?! ?/span>

大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′,3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產(chǎn)生的一個大片段,有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性,無3′→5′外切酶活性??捎糜谌笨诜g(Nick translation)法標記核酸,也可用于DNA序列測定,修補DNA鏈等?! ?/span>

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等,可水解相應(yīng)的DNA和RNA,核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA,用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)?! ∧┒宿D(zhuǎn)移酶在Mg2+存在下,選擇3′-OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸,在Co2+存在下,選擇3′-OH端雙鏈DNA為引物加成核苷酸,形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端標記和核酸連接的互補多聚尾(連接器)?! A性磷酸酶去除5′-P,可防止二分子DNA片段5′端P基團自身空間障礙,影響DNA分子之間的連接,一般用堿性磷酸酶處理載體DNA除去5′端P基團,在連接酶作用下目的基因的5′端P先與載體3′端OH連接,再通過復(fù)制修復(fù)另一條鏈,使二  

二、目 的 基 因  

常把需研究的基因稱為目的基因,需分析的基因稱靶基因,在基因克隆過程中有時兩者均稱為插入基因,有時三者含義相近。簡單的原核生物目的基因可從細胞核中直接分離得到,但人類的基因分布在23對染色體上,較難從直接法得到。簡短的目的基因可在了解一級結(jié)構(gòu)或通過了解多肽鏈一級結(jié)構(gòu)氨基酸編碼的核苷酸序列基礎(chǔ)上人工合成。但多數(shù)的目的基因由mRNA合成cDNA(complementary DNA,反轉(zhuǎn)錄DNA)得到。CDNA通過各種方式與載體連接,克隆可得到全長cDNA或片段,用于探針制備、序列分析、基因表達等研究。因此以cDNA為研究材料反映了mRNA的轉(zhuǎn)錄及對以后翻譯的影響情況,即反映某一基因(DNA)外顯子的情況。 

    三、基因庫的建立  建立基因庫的目的是為了便于目的基因的保存、擴增和純化。基因庫是利用工具酶,通過基因重組技術(shù)和轉(zhuǎn)化、篩選而建立,也是基因克隆的過程。實際上是利用低等生物如細菌、病毒、噬菌體等生長快,繁殖力強的特點,而作為一種核酸擴增篩選的載體,把人類等高等生物的基因或其片段用工具酶插入,重組于其中,經(jīng)篩選,克隆得到目的基因與載體重組的重組基因,成為便于保存,取用方便的基因庫。基因庫交流是研究室之間交流目的基因的常用方式。  

(一)基因重組  基因重組方案很多,簡單的可用同一種限制性內(nèi)切酶分別在載體和目的基因切出相對應(yīng)的切口,便于連接。也可用末端連接酶合成連接器(圖18-3)。近年,Okayama方案為實驗室普遍采用,該方法可得到全長的cDNA?! 。ǘ┺D(zhuǎn)化  轉(zhuǎn)化目的是把有復(fù)制能力,但在細胞外無復(fù)制活性的目的基因-載體重組體裝入細胞(大腸埃希菌),使目的基因隨載體在細胞內(nèi)復(fù)制、擴增。實驗步驟介紹如下:

基因重組方案之一  

⒈大腸埃希菌的處理(增加細胞膜通透性,便于基因進入細胞)大腸埃希菌(E.Coli cells)接種于Lb agar培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)一晚。挑選3~5個大菌落,接種于50ml LB培養(yǎng)基,37℃,振搖培養(yǎng)一晚后,在A550測定,要求細菌繁殖一定量(一般為細菌對數(shù)生長期),野生型(rec+,5x107cells/ml)為0.2-0.3,缺陷型(rec-,5x107cells/ml)為0.5-0.6。離心棄去上清液,用20ml,50mmol/L,CaCl2懸浮菌體。冰浴20分鐘,低溫離心。棄上清液,用2.5ml冰50mmol/l CaCl2懸浮。4℃可保存48小時,用于轉(zhuǎn)化,稱competent cells?! 、操|(zhì)粒(如經(jīng)基因重組建立的重組質(zhì)粒,基因庫等)的轉(zhuǎn)化 將competent cells(以美國BRL公司DH10B菌株為例)置冰水浴。同時將Falcon2059(傳熱系數(shù)穩(wěn)定)塑料試管置冰水浴。取100μl菌液(DH10B)于2059試管中,加10倍稀釋的巰基乙醇1μl,冰浴輕搖2分鐘,放置10分鐘。取0.1-50ng質(zhì)粒加入試管,輕輕搖勻,冰浴30分鐘。此間備好42℃水浴。并將SOC培養(yǎng)基置42℃?zhèn)溆?。將試管置?2℃,輕搖45秒鐘,馬上置冰浴2分鐘。使competent cells熱脹冷縮,把質(zhì)粒導(dǎo)入菌體。加42℃SOC培養(yǎng)基0.9ml于試管,37℃培養(yǎng)1小時。1000rpm離心10分鐘,棄上清液,用200μlSOC培養(yǎng)基懸浮菌體。接種于LB-氨芐青霉素(100U/ml)培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)一晚。已轉(zhuǎn)化的菌體可形成菌落(因質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素基因)。在了解目的基因或其產(chǎn)物的基礎(chǔ)上對菌落進行鑒定。并在LB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)?;驇斓慕?、轉(zhuǎn)化、篩選、擴增、純化的過程就是基因克隆的過程。  LB培養(yǎng)基(1L):10g蛋白胨,5g酵母膏,10g NaCl,高壓滅菌,pH7.5?! OB培養(yǎng)基(1L):20g蛋白胨,5g酵母膏,0.5g NaCl,高壓滅菌。另外準備2mol/L鎂溶液(1mol/L氯化鎂與1mol/L硫酸鎂等量混勻,過濾滅菌),臨用前加1ml于100ml培養(yǎng)基。  SOC培養(yǎng)基(100ml):臨用前加入1ml過濾滅菌的2mol/L葡萄糖?! ?/span>

四、核酸的分離與純化  核酸存在于多種細胞,如病毒、細菌、寄生蟲、動植物細胞;多種標本中,如血液、組織、唾液、尿液等其它來源的標本。因此分離方法復(fù)雜而多樣。又因各種DNA、RNA的豐度差異,各種分析方法對核酸的純度與量的要求有差異,因此在實驗前應(yīng)對采用的方法有所了解和選擇??偟恼f來核酸的分離與純化是在溶解細胞的基礎(chǔ)上,利用苯酚等有機溶劑抽提(核酸溶于緩沖液,即水相),分離,純化;乙醇、丙酮等有機溶劑沉淀,收獲。溶解細胞的方法因標本不同而不同,有用SDS加NaOH,有用蛋白酶,有的用超聲波破碎等方法,苯酚提取主要使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機相,而核酸保留在水相,達到分離核酸的目的。實驗上生物標本中含量zui多的就是蛋白質(zhì)。為了除去分離過程中殘留的有機溶劑,常用的方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸,通過離心回收核酸,然后用70%-80%乙醇洗滌沉淀,除去多余的鹽,以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反應(yīng)。為了得到純的核酸可用蛋白酶除去蛋白,用RNA酶除去RNA,得到純的DNA,用DNA酶除去DNA而獲得RNA。目前開發(fā)了許多商品化的核酸分離柱,可簡單、快速地分離得到純度很高的DNA或RNA。其分離原理有的利用核酸的分子量差異,有的利用需分離核酸的特點與其特異性結(jié)合達到分離、回收的目的。 ?。ㄒ唬┵|(zhì)粒的分離與純化  含質(zhì)粒的E. Coli cells經(jīng)LB培養(yǎng)液250ml擴大培養(yǎng),倒入50ml離心管,4℃,3000rpm,離心15分鐘。棄去上清液。(棄去液丟棄前應(yīng)作消毒處理,以免污染環(huán)境)。加lysis buffer(50mmol/L Glucose,10mmol/l EDTA,25mmol/l Tris-HCl,pH8.0)1-2ml使之懸浮。放置室溫5分鐘,加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液(1mol/l NaOH 8ml,20%SDs 2ml,蒸餾水30ml)上下?lián)u勻,置冰水浴5分鐘。禁用混勻器,以免DNA分子斷裂),加2.5mol/L醋酸鉀緩沖液(pH4.8)2.6-5.2ml,上下?lián)u勻,冰浴5分鐘。4℃,3000rpm,離心15分鐘。沉淀蛋白質(zhì)。取上清液,加無水乙醇12-24ml(上清液的二倍)放室溫15分鐘后,10000rpm離心,棄上清液。加約為沉淀物體積的0.4倍TE(10mmol/l Tris-Hcl pH8.0,10mmol/l EDTA)溶解沉淀后,加0.2倍的7.5mol/L醋酸銨。可用混勻器混勻,置冰浴10分鐘。4℃,10000rpm離心5min,棄上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5,10mmol/l EDTA緩沖液,1/10體積的5mg/ml RNase,37℃,30分鐘保溫。加等量的phenol(酚)/CIAA(480ml,20ml異戊醇),混勻。4℃,10000rpm,離心5分鐘。取上層液加酚/CIAA重復(fù)一次。取上層液加1/10體積5mol/l NaCl和2倍無水乙醇,―20℃過夜或―70℃2小時以上。4℃,10000rpm,離心10分鐘,棄上清液。加80%乙醇不搖動,直接10000rpm離心,棄上清液,真空干燥。加適量(約200μl)TE溶解。測定含量后備用?! 。ǘ┲亟M質(zhì)粒中目的基因的分離與純化  先取少量純化的重組質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶切出目的基因,經(jīng)電泳分離,確認。以200μl含2mg DNA(重組質(zhì)粒)為例:取10μl含100μg DNA,加90μl TE。按1μg DNA加2-5U限制性內(nèi)切酶,1/10體積緩沖液,1-2小時保溫。緩沖液種類和酶反應(yīng)溫度因內(nèi)切酶種類而異。1/10體積3mol/l NaAc,2倍無水乙醇,-70℃,2小時(-20℃過夜),10000rpm,10分鐘離心,棄上清液(乙醇沉淀)。適量TE溶解沉淀(切斷的DNA質(zhì)粒與目的基因混合物),電泳分離(用相應(yīng)分子量DNA標準同時電泳),在紫外光下觀察結(jié)果,與標準DNA分子量比較,確認目的基因和內(nèi)切酶的切割效果?! ?/span>

⒈電泳條件:
凝膠制備:1%瓊脂糖凝膠agarose(mg)X50TAE(ml)EB(溴化乙錠μl) 

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