層析分離技術是我國高?!渡治鰧嶒灐分械幕A實驗。70年代后期國內研制的“核酸蛋白檢測儀",使用某一波長(280nm或254nm等)進行定性檢測分離,用記錄儀描譜,長期在高校實驗室使用。在我國科技人員努力下,近年來,市場上相繼出現(xiàn)了可代替記錄儀的“電腦采集器"、“電腦核酸蛋白檢測儀"、“雙波長電腦核酸蛋白檢測儀"、“層析-電導聯(lián)用系統(tǒng)"等產(chǎn)品,迅速應用到教學實驗、科學研究和藥物生產(chǎn)領域。
一、 檢測原理
所有紫外吸收檢測器工作原理都是基于光的吸收定律---朗伯-比耳定律。該定律指出,當一束單色光(λ)輻射通過稀濃度物質溶液時,如果溶劑不吸收光,則液體的吸光度與吸光物質的濃度和光經(jīng)過溶液的距離成正比。其關系式為:
A(λ)=a(λ)bc
A=-LgT=Lg1/T
二、層析裝置分類:
按描譜方式分有:記錄儀描譜和電腦描譜(外加采集分析器)
按檢測波長分有:單波長檢測和雙波長(多波長)同步檢測
按檢驗器分有:核酸蛋白檢測和核酸蛋白檢測、電導檢測聯(lián)用
三、傳統(tǒng)檢測儀:
傳統(tǒng)層析實驗裝置由單波長核酸蛋白檢測儀(外加電腦采集器或將電腦采集器裝入檢測儀中也屬此類)、層析柱、恒流泵、部分收集器和記錄儀等部件構成。用一種波長(如280nm或254nm等)下對已知物質(蛋白或核酸等)進行實驗檢測,高校實驗室的層析實驗裝置大多屬于此類。特點如下:
1、檢測前必須選定一種波長(280nm、254nm)進行檢測,利用物質特征波長分離已知組分。
2、要求學生在檢測前一定要先調整透過率為100%,然后再調整吸光度為0。學生經(jīng)常會問:雖然透過率和吸光度在此點(T=100%,A=0)符合了A=lg(1/T)關系,但怎樣保證在測量范圍內都符合朗伯--比爾定律?
3、傳統(tǒng)檢測儀為保證測量讀數(shù)落在儀器有效測量范圍內,在儀器面板上都設有靈敏度選擇裝置(2.0A、1.0A、0.、0.2A、0.1A、0.0等)。因此,測量前要選擇合適的靈敏度;②真正吸光度值是儀器顯示數(shù)與靈敏度的乘積;③測量中不要改變靈敏度,否則可能會帶來基線變化。
4、傳統(tǒng)檢測儀在不同靈敏下的測量結果均為0-10mv直流信號,將此信號輸出到記錄儀或電腦采集器。顯然,記錄紙或電腦屏幕上的吸光度也并非樣品實際的吸光度,也應受到儀器靈敏度的調制。
四、新型檢測儀
以對蛋白、核酸、肽等生物大分子物質的檢測、分離和純化為目的,新型層析實驗系統(tǒng)中的電腦核酸蛋白檢測系統(tǒng)具有以下特點:
1、系統(tǒng)智能調整吸光度到0.000,透光率到100%。,并在測量范圍內的吸光度和透過率嚴格符合A=Lg(1/T)。
2、單波長檢測或雙波長同步檢測。
3、系統(tǒng)自帶數(shù)據(jù)采集工作站,檢測、采集、軟件工作站一體化系統(tǒng)集成。分析軟件具有實時描譜、分析參數(shù)、圖譜保存、圖譜打印、圖譜編輯等功能,提供峰高、峰寬、峰面積、歸一化、保留時間、半峰寬、峰底寬、面積含量、純度、層析柱分辯率等參數(shù)。
zui近出現(xiàn)的“單波長核酸蛋白檢測_電導檢測聯(lián)用系統(tǒng)"、“雙波長核酸蛋白檢測_電導檢測聯(lián)用系統(tǒng)"和“三波長核酸蛋白檢測_電導檢測聯(lián)用系統(tǒng)"等產(chǎn)品,為科學研究、尋找目標物分離條件和提高工作效率提供了新方法。