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PCR技術(shù)概述
更新時間:2015-05-11 點擊次數(shù):795

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)是基因擴增技術(shù)的一次重大革新,是分子生物學發(fā)展史中的一個重要里程碑。使用PCR擴增技術(shù),可以將極微量的靶DNA片段特異地擴增上百萬倍,大大提高了對DNA分子的分析和檢測能力。PCR技術(shù)具有敏感度高、特異性強、快速簡便等優(yōu)點,在醫(yī)學、遺傳學、法醫(yī)學、微生物學、食品檢驗、衛(wèi)生檢驗等眾多領域中具有巨大的應用價值和廣闊的發(fā)展前景。
 

耐熱DNA聚合酶的應用是PCR技術(shù)的核心。根據(jù)是否具有3’→5’端外切酶活性,耐熱DNA聚合酶通常分為無校讀活性和有校讀活性兩類。無校讀活性的DNA聚合酶(以Taq 酶為代表)具有較高的擴增效率,但由于缺乏校讀活性,容易發(fā)生堿基錯配,故產(chǎn)物中點突變較多。Taq DNA聚合酶還具有末端轉(zhuǎn)移酶活性,可在PCR產(chǎn)物的3’末端非特異地添加堿基,因單個A突出堿基的比例zui高,故PCR產(chǎn)物可直接與含有3’末端突出T堿基的載體連接(即TA克隆),方便PCR產(chǎn)物的克隆、擴增和測序。然而,TaqDNA聚合酶在PCR反應*步升溫過程中即可催化錯配引物延伸或引物二聚體形成,因而導致非特異性擴增,影響目的片段的合成量。針對這一現(xiàn)象設計的熱啟動Taq DNA聚合酶,在低溫時其聚合酶活性被抑制,通過高溫變性,聚合酶的活性恢復,催化特異性結(jié)合的引物擴增,因而提高了目的片段的特異性和產(chǎn)量。另一類有校讀活性的DNA聚合酶(以Pfu為代表)可選擇性地去除錯誤摻入的dNTP,維持DNA鏈的正確延伸;然而其擴增效率通常低于Taq DNA聚合酶,特別是對于長片段DNA鏈的延伸能力較差。基于上述兩類酶的特點,可將適量的Taq DNA聚合酶與任意一種有校讀活性的DNA聚合酶混合,在適當?shù)姆磻彌_液體系中,可獲得保真性與擴增性能介于上述兩類酶之間的混合酶,用于長片段以及復雜模板的高保真擴增。
 

PCR實驗受諸多因素的影響。的商業(yè)化耐熱DNA聚合酶及其配套緩沖液通??梢詽M足絕大多數(shù)DNA片段擴增的需要。首先應根據(jù)模板的性質(zhì)(基因組、cDNA、質(zhì)粒等)和目的片段的大小、GC含量、有無二級結(jié)構(gòu)等,選擇合適的DNA聚合酶(參見GenStar? PCR產(chǎn)品選擇指南)。對于難于擴增的片段,應針對不同的模板、引物,優(yōu)化反應條件,以獲得*的擴增效率。
 

A. 模板用量:以50 μl反應體系為例
人基因組DNA0.1~1.0 μg
大腸桿菌基因組DNA10~100 ng
? λ DNA
0.5~5 ng
質(zhì)粒DNA0.1~10 ng
 

B. 引物設計原則:
引物長度要滿足特異性需要,一般可在18~25個堿基之間;擴增長片段時在24~30個堿基之間;
G+C%含量應盡量控制在40~60%,兩條引物的(G+C%含量應盡量接近;
盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上,3’端應避免使用AT
避免引物內(nèi)部自身配對形成二級結(jié)構(gòu);
正反向引物之間應避免配對堿基,尤其是3’端的三個堿基,否則易生成引物二聚體(Primer dimer);
兩條引物的Tm值應盡量接近,相差不超過5oC
引物Tm值的計算方法:
20 nt以下:Tm = 2xA + T+ 4xG+C
20 nt以上:Tm = 81.5+0.41xG+C%-600/ntnt:引物的堿基數(shù))
 

C. 引物用量:
? 0.1~1.0 μM,通常可以0.2 μM起始,根據(jù)體系不同調(diào)整用量;
使用簡并引物、隨機引物時,需增加引物總量以彌補產(chǎn)量損失;但隨著引物量加大,特異性將降低;
模板較大較多,或結(jié)構(gòu)較復雜(如人基因組DNA)時,需減少引物用量以提高特異性;
模板較小較少(如質(zhì)粒模板)時,增加引物用量可提高產(chǎn)量。

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