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實(shí)驗(yàn)原理
測定蛋白質(zhì)的定量方法有很多,目前常用的有凱氏定氮法;比色法主要包括雙縮脲法、Folin-酚試劑法及 染料結(jié)合法;紫外分光光度法等
雙縮脲(Biuret)法:在堿性溶液中,雙縮脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)與二價(jià)銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物,這一反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含二個(gè)或二個(gè)以上酰胺基(—CO—NH2),或與此相似的基團(tuán)[如—CH2—NH2,—CS—NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,無論這類基團(tuán)直接相連還是通過一個(gè)碳或氮原子間接相連,均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵(—CO—NH—),可發(fā)生雙縮脲反應(yīng),且呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比,可用比色法測定蛋白含量。與同樣處理的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較,經(jīng)計(jì)算或查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出血清總蛋白質(zhì)含量。
實(shí)驗(yàn)試劑
1.6mol/L氫氧化鈉溶液
稱取氫氧化鈉(NaOH,優(yōu)級純)240g,用新鮮蒸餾水配制成1L,置室溫貯存在密封的聚乙烯瓶里。
2.雙縮脲試劑
稱取未失結(jié)晶水的硫酸銅(CuSQ·5H20) 3.0g,溶于500m1新鮮蒸餾水中,加酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6.4H2O)9.0g,碘化鉀(KI)5.0g,待安全
溶解后,加入6mol/L氫氧化鈉溶液100ml,zui后加蒸餾水至1L。室溫貯存在密閉的聚乙烯瓶里,約穩(wěn)定6個(gè)月。
3.蛋白標(biāo)準(zhǔn)液
可用商品血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或定值質(zhì)控血清為標(biāo)準(zhǔn)。亦可收集混合新鮮血清,用凱氏定氮法標(biāo)定后,加疊氮鈉防腐(疊氮鈉的終濃0.5~1.0g/L),冰凍
保存。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
恒溫水浴箱、722(721)分光光度計(jì)、吸管、試管、坐標(biāo)紙
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 配制20g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 如蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為70g/L,則取此液2m1,加入新鮮蒸餾水5ml,混勻即成。
2. 按表操作
加入物(ml) 空白管 1 2 3 4 5 測定管
20g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 ~ 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ~
蒸餾水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 ~ 0.4
待測樣品液體 ~ ~ ~ ~ ~ ~ 0.1
雙縮脲試劑 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
相當(dāng)血液蛋白質(zhì)(g/L) ~ 20 40 60 80 100
混勻,置37℃水浴10min(或25℃30min),用540nm波長比色,以空白管調(diào)零,讀取各管吸光度。
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
1—5為標(biāo)準(zhǔn)曲線管,測得吸光度后,以吸光度為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)測定管吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相對應(yīng)的總蛋白濃度。
注意事項(xiàng)
1.雙縮脲試劑中,加入酒石酸鉀鈉,Cu2 形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子,以防止CuSO4·5H20不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO4·5H20之比
不低于3:1,加入KI作為抗氧化試劑。
2.雙縮脲試劑要封閉貯存.防止吸收空氣中的二氧化碳。
3.本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同,重復(fù)性好,幾乎不受溫度影響,*缺點(diǎn)是靈敏度較低。
4.黃疸血清.嚴(yán)重溶血對本法有明顯干擾。
5.本法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線是一條通過原點(diǎn)的直線,在100g/L濃度之內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
聯(lián)系方式
郵件:sh-jiapeng@163.com