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RNA實(shí)驗(yàn)和方案新手必讀(三)
更新時間:2015-07-03 點(diǎn)擊次數(shù):982

RNA分離:起始材料的破碎和勻漿

 

起始材料的有效破碎和勻漿對于所有總RNA分離操作來說都是必須的要求。破碎和勻漿是兩個獨(dú)立分開的步驟。

  • 破碎:對于組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜的*破碎對于釋放樣本中所有的RNA是必要的。不同樣本需要使用不同的方法以達(dá)到*的破碎效果。不*的破碎會導(dǎo)致RNA得率的顯著降低。
  • 勻漿:勻漿對于減少破碎后細(xì)胞裂解產(chǎn)物的粘性是十分必要的。勻漿能夠切斷高分子量的基因組DNA及其他高分子量的細(xì)胞組分,得到均勻的裂解產(chǎn)物。勻漿不夠*會導(dǎo)致RNA結(jié)合效率的下降而顯著降低得率。

某些破碎方法能夠同時對樣本起到勻漿作用,而其他方法還是需要專門的勻漿步驟。表針對不同樣本進(jìn)行破碎和勻漿的準(zhǔn)則全面概述了適用于多種起始材料的不同破碎和勻漿方法。當(dāng)您針對所使用的起始材料選擇合適的操作方法時,該表格可用來作為參考。下面也將針對破碎和勻漿方法進(jìn)行更為詳細(xì)的論述。

使用玻珠研磨機(jī)進(jìn)行破碎和勻漿

在使用玻珠研磨機(jī)破碎樣本的過程中,樣本與珠子被一起進(jìn)行高速攪拌。通過珠子與細(xì)胞碰撞時的流體動力切割和破碎作用,同步完成破碎和勻漿過程。破碎效率的影響因素有:

  • 珠子的大小和組成
  • 緩沖液與珠子的比例
  • 起始樣本的數(shù)量
  • 攪拌速度和設(shè)定
  • 處理時間

細(xì)菌破碎時所使用的理想珠型為0.1毫米(平均直徑)的玻璃珠,用于酵母和單細(xì)胞動物細(xì)胞時為0.5毫米的玻璃珠,對動植物組織則應(yīng)使用3–7毫米的不銹鋼珠。請確保玻璃珠經(jīng)過濃硝酸的預(yù)先潤洗?;蛘呖芍苯淤徺I和使用市售的經(jīng)酸洗滌過的玻璃珠。關(guān)于破碎的其他參數(shù)需要依據(jù)每一應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)定。植物材料以及相關(guān)的珠子和破碎管可先在液氮中預(yù)冷,破碎應(yīng)在無裂解緩沖液的條件下進(jìn)行。對于動物組織則應(yīng)使用干燥的冷凍粉碎。冷凍粉碎(無論是在玻珠研磨機(jī)中還是使用研缽和杵)不同于緩沖液裂解,不會對樣本同時起到勻漿作用。

使用轉(zhuǎn)子——定子勻漿器進(jìn)行破碎和勻漿

在裂解緩沖液的存在下,轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)可同時完成對動物組織的*破碎和勻漿,所需時間基于樣本的堅韌程度,可在5–90秒內(nèi)完成。轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)也可以用于細(xì)胞裂解產(chǎn)物的勻漿。轉(zhuǎn)子的超高速旋轉(zhuǎn)能夠以擾動和機(jī)械剪切的綜合方式,完成對樣本的破碎和勻漿。使用適當(dāng)大小的管子,在勻漿過程中始終保證勻漿器頭部一直處于浸沒狀態(tài),并持續(xù)將勻漿器頭部伸入管子末端,以確保勻漿過程中樣本內(nèi)的泡沫達(dá)到zui少。轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)有不同大小型號可供選擇,并可裝配不同大小的探頭。5 mm和7 mm的探頭適合在300 μl以下的體積內(nèi)使用,并可用于離心管內(nèi)的勻漿。10 mm及以上尺寸的探頭則適用于更大的管子。

使用研缽和杵破碎

使用研缽和杵破碎時,先將樣本進(jìn)行迅速的液氮冷凍,并在液氮中將其研磨為細(xì)粉。將上清液(組織粉末和液氮)轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的適當(dāng)大小的管中,使液氮揮發(fā)但不要讓樣品融解。加入裂解緩沖液,并盡可能快地進(jìn)行后續(xù)步驟。

注:使用研缽和杵研磨樣品會破碎樣品,但無法達(dá)到勻漿的目的。勻漿作用需與此步驟分開進(jìn)行。

使用注射器和針頭完成勻漿

細(xì)胞和組織的裂解產(chǎn)物可以使用注射器和針頭進(jìn)行勻漿。可以使用20號(0.9 mm)針頭連接一個滅菌塑料注射器,通過至少5–10次的吹打切斷高分子量的DNA,直至裂解產(chǎn)物的勻漿形成。為操作便利和減少樣品損失,也可能需要增加裂解緩沖液的體積。

   針對不同樣本進(jìn)行破碎和勻漿的準(zhǔn)則

起始材料

破碎方法

勻漿方法

評論

培養(yǎng)的動物細(xì)胞

加入裂解緩沖液

使用轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)或注射器和針頭獲取胞質(zhì)RNA

如果處理少于1x105個細(xì)胞,可以使用渦動勻漿裂解產(chǎn)物。不提供勻漿方案。

動物組織

轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)

轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)

同步進(jìn)行破碎和勻漿

動物組織

研缽和杵

注射器和針頭

使用轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)和玻珠研磨機(jī)通常比使用研缽和杵的得率更高。

動物組織

玻珠研磨機(jī)

玻珠研磨機(jī)

 

細(xì)菌

加入裂解緩沖液進(jìn)行酶(溶菌酶)解

渦旋機(jī)

如果處理大于5x108個細(xì)胞,使用注射器和針頭進(jìn)行勻漿可能會增加得率。

細(xì)菌

玻珠研磨機(jī)

玻珠研磨機(jī)

玻珠研磨機(jī)可同時完成破碎和勻漿;不能使用渦動操作代替玻珠研磨機(jī)。

酵母

酶解(溶菌酶/消解酶)細(xì)胞壁后加入裂解緩沖液,以消化原生質(zhì)球。

渦旋機(jī)

 

酵母

玻珠研磨機(jī)

玻珠研磨機(jī)

玻珠研磨機(jī)可同時完成破碎和勻漿;不能使用渦動操作代替玻珠研磨機(jī)。

植物和絲狀真菌

研缽和杵

注射器和針頭

研缽和杵不能代替轉(zhuǎn)子–定子勻漿機(jī)。

   從不同樣本來源分離RNA的特別注意事項

一些樣本來源在其RNA或內(nèi)含物方面存在著顯著不同,可能導(dǎo)致RNA的分離和分析過程出現(xiàn)問題。當(dāng)操作這些樣本來源時需要一些特別注意事項。本節(jié)將針對大量不同樣本來源的操作進(jìn)行探討。

植物

從植物材料中分離RNA會遇到一些特殊困難,常規(guī)技術(shù)在用于植物樣本之前一般要先經(jīng)過條件優(yōu)化。一些植物代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)與核酸相似,導(dǎo)致其難于從RNA制備產(chǎn)物中除去。(使用不當(dāng)?shù)模┘兓椒ǎㄈ琨}類或苯酚)所導(dǎo)致的代謝物(例如多糖類、多酚類和黃酮類)或污染物與目的RNA的共分離,可能造成對酶促反應(yīng)的抑制,或?qū)е伦贤夥止夤舛葴y定和凝膠電泳結(jié)果上的偏差。從植物材料中分離RNA的過程中可能遇到的困難還包括由于較高粘性導(dǎo)致的吸取體積錯誤,以及儲存過程中的RNA降解問題。

通常對植物的生長條件進(jìn)行優(yōu)化,使其不產(chǎn)生高水平的植物代謝產(chǎn)物,可有助于對RNA的有效分離。由于植物種類之間存在較大差異,因此對其生長條件很難有同一的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)。不過作為普適原則,建議盡可能使用健康幼嫩的植物組織。年輕植物組織的RNA得率通常高于年老組織,因?yàn)榍罢咴诘戎貤l件下通常比后者包含更多的細(xì)胞。而且等重的年輕組織通常也包含更少的代謝物。此外,許多“自定義"的RNA分離方法都推薦將植物組織在黑暗中培養(yǎng)1–2天后再進(jìn)行收獲,以避免形成植物代謝物的高水平積累。

心臟、肌肉和皮膚組織

從例如骨骼肌、心臟和皮膚組織一類的樣本中分離RNA可能比較困難,因?yàn)榇祟悩悠分泻写罅康氖湛s性蛋白、結(jié)締組織和膠原。為了去除這些可能對RNA分離造成干擾的蛋白,需要使用蛋白酶或含苯酚的裂解試劑對此類樣本進(jìn)行處理。不過,蛋白酶的消化過程需要避免RNA發(fā)生降解。

細(xì)菌

細(xì)菌mRNA的很多基本特征都不同于真核生物的mRNA。原核生物的mRNA沒有5’帽子,也很少具有poly A尾。缺少poly A尾的mRNA無法通過雜交進(jìn)行捕獲。另外,也無法在合成初始鏈的過程中使用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷(oligo–dT)引物,只能使用隨機(jī)引物作為替代。

此外,細(xì)菌RNA也十分地不穩(wěn)定,快速生長的品種中RNA的平均半衰期約為3分鐘。某些細(xì)菌的mRNA在翻譯同時即發(fā)生降解。因此對于嘗試從細(xì)菌中分離mRNA的研究人員來說,這可算是一個麻煩。也由于細(xì)菌中的mRNA的周轉(zhuǎn)(從生成到降解)非???,造成原核生物的基因表達(dá)研究比真核生物更為困難。為了地保留基因表達(dá)譜,并使完好mRNA的得率zui大化,在樣本獲取和加工之前需要對其進(jìn)行穩(wěn)定處理。

血液

血液直接源于臨床分析的收集樣本。在收集管中使用RNA穩(wěn)定處理試劑可成功保存血液樣本的RNA。從血液中分離RNA的方法,需要能夠確保生成無污染物或酶抑制劑的高質(zhì)量RNA。血液中所含有的大量酶抑制劑會對下游的RNA分析造成干擾。此外,如肝素和EDTA等一類常規(guī)的抗凝血劑也會干擾下游分析。應(yīng)注意抗凝血劑并不會對RNA起到穩(wěn)定化作用。

人類血液中的紅血球(血紅細(xì)胞)不含細(xì)胞核,因此不會合成RNA;通常情況下這類細(xì)胞僅含有非常微量的RNA,而不是RNA分離的主要對象。從全血中分離RNA的主要靶標(biāo)細(xì)胞為白血球(白細(xì)胞),這類細(xì)胞含有細(xì)胞核和RNA。白血球由三種主要的細(xì)胞類型構(gòu)成:淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。

由于健康的血液中所含的紅細(xì)胞數(shù)量約為白細(xì)胞的1000倍,去除紅細(xì)胞會有助于簡化RNA分離步驟??赏ㄟ^選擇性地裂解紅細(xì)胞來達(dá)到此目的,因?yàn)榧t細(xì)胞對低滲休克更為敏感(相比白血球),在低滲緩沖液中會迅速發(fā)生破裂。

裂解紅細(xì)胞的另一種常見替代方法是Ficoll密度——梯度離心法。與紅血球裂解法不同,F(xiàn)icoll密度——梯度離心法僅獲取單核的細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞),而會去除粒細(xì)胞。經(jīng)Ficoll密度––梯度離心法分離出的單核細(xì)胞能夠使用與其他動物細(xì)胞一樣的方法進(jìn)行RNA分離。

FFPE組織樣品

福爾馬林固定,石蠟包埋(FFPE)的組織樣本是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要和廣泛的樣本來源。越來越多的研究者開始針對FFPE樣本開始分子水平的分析,因此考慮這些樣本的*屬性以發(fā)展針對性的分離方法變得越來越重要。

由于在固定和包埋過程中使用了甲醛,通常會使FFPE樣本中的核酸發(fā)生嚴(yán)重的片段化和化學(xué)改變。因此,從FFPE樣本中分離到的核酸會比新鮮樣本或冰凍樣本的分子量更低。其片段化程度基于樣本類型、保存期長短,以及固定、包埋和儲存的條件而發(fā)生變化。盡管在凝膠電泳或芯片實(shí)驗(yàn)室(lab–on–a–chip)分析等標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制分析中無法測得甲醛修飾情況,但后者實(shí)際會對酶學(xué)分析造成嚴(yán)重干擾。

為了將FFPE儲存法對RNA轉(zhuǎn)錄物的影響降至zui低,應(yīng)牢記下列小貼士:

  • 盡可能快地取樣和固定組織
  • 不要使用厚度超過5 mm的樣本,樣本固定時間不宜過長(zui長24小時)
  • 使用的試劑進(jìn)行石蠟包埋,不要加入其它添加劑
  • 盡可能避免對樣本進(jìn)行染色
  • 適當(dāng)?shù)貎Υ鍲FPE樣本(RNA在4°C可完好保存至1年,優(yōu)于保存在室溫或更高溫度)
  • 使用適當(dāng)?shù)拿撌灢襟E
  • RNA分離應(yīng)包含一個解交聯(lián)的步驟

   特定RNA病毒

病毒

基因組

Adenoviridae

Adenovirus

dsDNA

Arenaviridae

Lassa virus

ssRNA

Bornaviridae

Borna disease virus

ssRNA

Bunyaviridae

Hantaan virus

ssRNA

Caliciviridae

Hepatitis E virus, Norwalk virus

ssRNA

Filoviridae

Ebola virus

ssRNA

Flaviviridae

Hepatitis C and G viruses, Dengue virus

ssRNA

Hepadnaviridae

Hepatitis B virus

ss/dsDNA

Herpesviridae

Herpesviruses (HSV; CMV; EBV; HHV6, 7, 8)

dsDNA

Papovaviridae

Human papillomavirus, JC virus

ssDNA

Paramyxoviridae

Parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, rubulavirus

ssRNA

Parvoviridae

Parvovirus B19 (erythrovirus)

ssDNA

Picornaviridae

Coxsackie virus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, poliovirus, rhinovirus

ssRNA

Reoviridae

Rotavirus

dsRNA

Retroviridae

Human foamy virus, human immunodeficiency virus, human T-cell leukemia virus

ssRNA

Rhabdoviridae

Rabies virus

ssRNA

   RNA的儲存

 

純RNA可以儲存在–20°C或–70°C的不含RNase的水中。在上述條件下,1年內(nèi)都不會發(fā)生RNA降解。


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