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在檢測RNA樣本時,需確保比色杯中去除了RNA酶,特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。該條件可通過使用0.1 M NaOH,1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來實現(xiàn)。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計設定空白對照。 | |||||||||||||||
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在使用紫外通透的塑料比色杯的分光光度計中,測量260 nm的吸光值(A260)以確定RNA的濃度。為了確保獲得有意義的結(jié)果,讀值應在0.15與1.0之間。在260 nm波長下,1個單位的吸光值對應每毫升44 μg的RNA濃度(A260=1 → 44 μg/ml;基于標準的1 cm測光距離)。這一相關(guān)性僅對中性pH值條件下的檢測有效。因此,如需稀釋RNA樣品,則應使用中性pH值的低鹽緩沖液(例如10 mM Tris?Cl ,pH7.0)。 在檢測RNA樣本時,需確保比色杯中去除了RNA酶,特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。這可以通過使用0.1 M NaOH,1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來實現(xiàn)。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計設定空白對照。列舉一個RNA定量中的計算實例如下: RNA定量舉例 RNA濃度 RNA總量
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RNA純度 在260 nm與280 nm讀值之間的比例(A260/A280)能夠反映RNA的純度,因為如蛋白一類的污染物會吸收紫外光。不過,A260/A280的比值也受到pH值的顯著影響。當使用沒有緩沖能力的水時,pH值與A260/A280的比值結(jié)果都會發(fā)生大范圍的改變。 較低的pH值會導致A260/A280的比值變小,對蛋白質(zhì)污染的敏感性也會隨之降低(3)。 為了獲得的比率,我們建議在微堿的低鹽緩沖液中檢測吸光度(例如10 mM Tris?Cl,pH7.5)。在10 mM Tris?Cl,pH 7.5緩沖液當中,純RNA的A260/A280 比率約為1.9–2.1。 注:某些分光光度計在檢測純RNA時,可常規(guī)獲得高達2.3的比值。 請確保使用同種溶液校準分光光度計。不過,為了準確確定RNA的濃度,我們?nèi)越ㄗh使用中性緩沖液稀釋RNA樣本,因為吸光度和濃度(A260讀值為1相當于44 μg/ml的RNA濃度)之間的關(guān)系是一個基于中性條件獲得的吸光系數(shù)。 RNA的完整度 總RNA的完整度和大小分布可以通過變性的瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色或市售的檢測系統(tǒng)(如QIAxcel系統(tǒng)或Agilent 2100 )進行檢測。每條核糖體RNA的富集區(qū)域在凝膠染色之后應顯現(xiàn)為銳利的條帶。28S核糖體RNA的條帶亮度應為18S rRNA條帶的兩倍左右。如果某一泳道中核糖體RNA條帶不夠銳利,卻出現(xiàn)小尺寸RNA的彌散情況,則很可能因為RNA樣品在制備過程中發(fā)生了嚴重的降解。 Agilent 2100 Bioanalyzer也能夠提供RNA完整數(shù)目(RNA Integrity Number,RIN)這一參數(shù),作為對RNA完整度的一個有用量度。在理想情況下RIN值應接近10,不過在許多情況下(特別是對組織樣本來說),RNA品質(zhì)主要取決于原始樣本的保存情況。 不同來源的核糖體RNA大小
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變性凝膠分析的原理 利用RNA在甲醛瓊脂糖凝膠中的電荷遷移效應,可對RNA進行分離和鑒定。RNA不像DNA,它們具有復雜的二級結(jié)構(gòu),因此需使用變性凝膠。凝膠中的甲醛能夠破壞RNA的二級結(jié)構(gòu),從而使得RNA分子嚴格按照電荷遷移的方式得到有效分離。 在電場中,主鏈磷酸基團上所攜帶的負電荷使核酸分子向陽極移動。變性的RNA分子的遷移速率取決于它們的尺寸大小;不過片段大小與遷移速率之間并非線性相關(guān),因為更大的片段會遇到更大的摩擦阻力,在凝膠中移動更為困難。 瓊脂糖凝膠分析是zui為常用的RNA分析方法,通常依據(jù)RNA的大小相應選擇合適分辨范圍的瓊脂糖凝膠。小的RNA片段,如tRNA或5S rRNA,可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。可查閱分子生物學手冊(2,4)以獲得關(guān)于各類分析膠的詳細信息。本節(jié)將針對甲醛瓊脂糖凝膠電泳進行介紹。 制備用于RNA分析的甲醛瓊脂糖凝膠 下列甲醛瓊脂糖(FA)凝膠電泳方案能夠提高凝膠分離及后續(xù)檢測(例如RNA印跡)的靈敏度。本方案的關(guān)鍵特點在于使用了濃縮的RNA上樣緩沖液,從而(相比傳統(tǒng)實驗方案)能夠向凝膠中載入更大量的RNA樣本。 瓊脂糖 用于制備凝膠的瓊脂糖是針對所分離RNA片段的大小來確定濃度范圍的。對于大多數(shù)的目的RNA種類來說,使用1.0–1.2%(質(zhì)量體積比)的瓊脂糖濃度可獲得*結(jié)果。對于較大的mRNA種類,降低瓊脂糖濃度可能會有所幫助。如需分離更小的mRNA,瓊脂糖濃度可提高至2%。對于較小的RNA種類,如tRNA或rRNA,則推薦使用聚丙烯酰胺凝膠電泳。 請使用超純瓊脂糖,因為如多糖類、鹽類和蛋白一類的雜質(zhì)都會對RNA的遷移造成影響。 小貼士:某些電泳槽的塑料不耐乙醇。請對此適當留意,并核對廠商的說明書。
每個泳道10ug RNA |
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